Антимикробные пептиды: многофункциональные препараты для различных применений

Антимикробные пептиды (АП) являются важной частью врожденной иммунной системы на эпителиальных и неэпителиальных поверхностях. До сих пор у позвоночных и позвоночных животных было обнаружено множество различных антимикробных пептидов из различных семейств.

Они характеризуются антибиотической, противогрибковой и противовирусной активностью в отношении различных микроорганизмов. В дополнение к своей роли эндогенных противомикробных препаратов, АП участвуют во многих аспектах иммунитета.

Они участвуют в септическом и не септическом воспалении, заживлении ран, ангиогенезе, регуляции адаптивной иммунной системы и в поддержании гомеостаза.

Благодаря этим характеристикам AP может играть важную роль во многих практических приложениях. Ограниченная терапевтическая эффективность современных противомикробных средств и возникающая устойчивость патогенов требуют альтернативных противомикробных препаратов.

Цель этого обзора — осветить современную литературу о функциях и механизмах антимикробных пептидов. В нем также показано их текущее практическое применение в качестве пептидной терапии и биоактивных полимеров и обсуждаются возможности будущих клинических разработок.

1. Введение

Термин «Антимикробные пептиды» (АП) используется для описания большого количества небольших белков, которые могут убивать или подавлять рост различных микроорганизмов. Они были впервые обнаружены в конце 1980-х годов у африканской когтистой лягушки Xenopus laevis и, как было доказано, обеспечивают естественную защиту от инфекций.

Этот класс катионных пептидов, называемых магайнинами, проявлял широкий спектр активности, включая противогрибковую и противопаразитарную активность.

В последующие десятилетия было идентифицировано и выделено множество различных пептидов, также называемых пептидами защиты хозяина, из многих организмов, включая растения, бактерии, грибы, насекомых и позвоночных. АП играют важную роль в врожденной иммунной системе, являясь первой линией защиты от инфекций.

Растениям и беспозвоночным не хватает определенных элементов адаптивной иммунной системы, поэтому АП обеспечивают важнейший защитный механизм. В растениях присутствие АП предотвращает колонизацию бактерий и грибов. У млекопитающих АП сохраняются и локализуются преимущественно на эпителиальных и неэпителиальных поверхностях, где они поддерживают барьерную функцию и предотвращают микробные инвазии.

АП впервые были выделены из фагоцитарных клеток иммунной системы, таких как нейтрофильные гранулоциты, но также были обнаружены в мезенхимальной ткани, такой как суставной хрящ, или в эпителиальных клетках слизистой оболочки. В коже они участвуют в поддержании барьерных функций кератиноцитов, а также в поддержании гематоэнцефалического барьера и мозговых оболочек головного мозга.

АП характеризуются небольшим размером (12-50 аминокислот), остатками аргинина и лизина, ответственными за их положительный заряд, и амфипатической структурой, которая позволяет им взаимодействовать с микробными мембранами. Основываясь на первичных и вторичных структурных различиях, противомикробных потенциалах и воздействии на клетки-хозяева, APS можно разделить на различные семейства.

Поэтому у млекопитающих были описаны три семейства: дефензины, кателицидины и гистатины (см. Таблицу 1).

Пожалуйста, обратите внимание, что в дополнение к этим трем основным семействам было идентифицировано еще много пептидов, например, РНКаза 7, гепсидин или лактоферрин. Хороший обзор существующих АП предоставляет база данных антимикробных пептидов (APC).

Дефензины широко экспрессируются, проявляют бактерицидную, противогрибковую и противовирусную активность и обогащены главным образом клетками и тканями, участвующими в защите хозяина. Из-за шести консервативных цистеинов в первичной структуре дефензинов специфическая структура и функция определяются тремя дисульфидными связями.

В соответствии с положением цистеинов, дефензины были классифицированы как α-, β- и θ-дефензины. У млекопитающих на поверхности кожи и слизистых оболочек были обнаружены высокие концентрации дефензинов. Кроме того, они обеспечивают гранулированные белки в нейтрофильных гранулоцитах (около 30%) и в клетках панет тонкой кишки. Однако родственные члены семейства дефензинов также были идентифицированы у растений (Arabidopsis thaliana) и позвоночных животных.

Кателицидины определяются высококонсервативным N-концевым про-доменом кателина и структурно изменяемым антимикробным доменом на С-конце. Они были идентифицированы у различных видов с существенными межвидовыми различиями в количестве выраженных различных членов семейства. У грызунов и людей известен один ген кателицидинов, тогда как другие млекопитающие, такие как свиньи, крупный рогатый скот и лошади, имеют несколько генов.

 У людей ген кателицидина кодирует неактивный белок-предшественник (hCAP18), который обрабатывается для высвобождения пептида из 37 аминокислот с двумя остатками лейцина в начале (LL-37) С-конца белка-предшественника. Кателицидины вырабатываются лейкоцитами, но недавние исследования показали, что они имеют широкое распространение, включая кожу, эпителий и ткани головного мозга. Следовательно, экспрессия не ограничивается лимфоидными органами или лейкоцитами.

Кателицидины убивают грамположительные и грамотрицательные бактерии. Интересно, что они могут проявлять противопаразитарную активность в отношении Trypanosoma cruzi. Недавние результаты также показали, что кателицидиноподобные пептиды присутствуют в растениях, в то время как у позвоночных представителей пока не обнаружено.

Третье основное семейство АП у млекопитающих, гистатины, включает различные мелкие катионные пептиды, богатые гистидином. Они конститутивно вырабатываются и секретируются слюнными железами полости рта, такими как околоушные, подчелюстные и подъязычные железы.  Они проявляют мощную бактерицидную, а также фунгицидную активность и, следовательно, играют важную роль в поддержании здоровья полости рта путем ограничения инфекций в полости рта. Гистатины до сих пор были выделены только у людей и приматов.

Экспрессия АП опосредуется главным образом рецепторами распознавания образов (PRR), которые распознают сохраненные молекулярные структуры, связанные с патогенами, такие как компоненты бактериальной клеточной стенки, бактериальная ДНК или белки вирусной оболочки. Например, как Toll-подобные рецепторы, так и рецепторы формилпептида участвуют в экспрессии AP.

Таблица 1. Основные семьи АМП человека и их члены

2. Разнообразие функций

2.1. Антимикробная Активность

Антибактериальная активность: АП проявляют антимикробную активность в отношении широкого спектра микроорганизмов, включая грамположительные и отрицательные бактерии, и существует несколько гипотез, описывающих функцию механизма. Первоначальный контакт между АП и микробом является электростатическим из-за анионной бактериальной поверхности.

Во-первых, положительно заряженные катионные пептиды (APS) связываются с отрицательно заряженными компонентами клеточной мембраны бактериальной клеточной стенки, такими как липополисахарид. Аминокислотный состав, амфипатичность, катионный заряд и размер позволяют им прикрепляться к мембранным бислоям и вставляться в них с образованием пор с помощью механизмов «бочонок-шест», «ковер» или «тороидальные поры» (см. Рис. 1).

Для бочкообразного стержня пептиды агрегируются и вставляются в бислой мембраны, чтобы выровнять гидрофобные пептидные области с областью липидного ядра. Гидрофильные пептидные области образуют внутреннюю сердцевину поры.

Для тороидальной формы пептиды агрегируются и заставляют липидные монослои непрерывно изгибаться через пору, так что водная сердцевина выстлана как вставленными пептидами, так и группами липидных головок, а для коврового канала пептиды разрушают мембрану, ориентируясь параллельно поверхности липидного бислоя и образуя обширный слой или ковер.

Это приводит к образованию переходного канала, мицелляризации, растворению мембраны или перемещению через мембраны, вызывающему увеличение проницаемости мембраны. Проницаемость обеспечивает отток необходимых ионов и питательных веществ, что приводит к быстрой гибели клеток.

В отличие от прокариотических мембран, мембраны млекопитающих обогащены цвиттерионными фосфолипидами (нейтральными по чистому заряду). Более того, присутствие холестерина, основного компонента мембран млекопитающих, может снижать активность АП путем стабилизации липидного бислоя или путем прямого взаимодействия и нейтрализации АП. Состав мембран, вероятно, станет важным определяющим фактором для АП.

Растущее количество доказательств указывает на то, что активность АП опосредована внутриклеточными мишенями. Молекулы АП проходят через мембрану, диссоциируют с ней и связываются с внутриклеточными мишенями (рис. 1). Они опосредуют активацию аутолитических ферментов, ингибирование биосинтеза клеточной стенки и синтеза ДНК, РНК и белка.

Эти внутриклеточные механизмы могут действовать независимо или синергически с проницаемостью мембран. Тем не менее, взаимодействие с мембраной бактериальной клетки, по-видимому, является механизмом уничтожения подавляющего большинства АП.

Дефензины проявляют бактерицидную активность против грамположительных и отрицательных бактерий и против различных штаммов дрожжей, таких как условно-патогенные дрожжи Candida albicans. Интересно, что исследования показывают, что дефензины накапливаются со значительно более высокой скоростью и в большей степени в поражениях, инфицированных бактериями и C. albicans, у мышей и кроликов по сравнению с незараженными, но воспаленными тканями.

Эти данные указывают на то, что пептиды различают микроорганизмы и ткани хозяина и при этом накапливаются в очагах инфекции in vivo. Инфекция приводит к снижению pH, что способствует накоплению AP.

Для кателицидинов наблюдалась корреляция между их антимикробной активностью и их структурой. Большая степень α-спиральной конформации благоприятна для их способности убивать как грамотрицательные, так и положительные бактерии. Кателицидины от овец и коров, миелоидный антимикробный пептид овец (SMAP-29) и бычий миелоидный антимикробный пептид (BMAP) соответственно, наряду с двумя дисульфидными мостиковыми протеинами от свиней, являются одними из наиболее быстрых и мощных АП.

Другой важной особенностью этих пептидов является их способность связывать и нейтрализовать бактериальный липополисахарид in vitro, что может объяснять способность экзогенно вводимых пептидов защищать от сепсиса in vivo. Однако несколько исследований показывают, что их активность чувствительна к изменениям условий анализа, включая соль, рН и фазу роста бактерий. Кателицидины оказывают цитотоксическое действие на эукариотические клетки, но это нейтрализуется компонентами сыворотки. Предполагается, что липопротеины сыворотки играют важную роль в защите клеток человека от повреждений, вызванных кателицидинами.

Рисунок 1. Предлагаемый механизм действия АП на бактерии

АП предлагается ассоциировать с отрицательно заряженной поверхностью внешней мембраны. Перечисленные модели, объясняющие механизмы проницаемости мембраны, включают:

(А) бочкообразный стержень: пептиды агрегируются и вставляются в двухслойную мембрану, чтобы выровнять гидрофобные пептидные области с областью липидного ядра. Гидрофильные пептидные области образуют внутреннюю сердцевину поры.

(B) Тороидальный: пептиды агрегируются и заставляют монослои липидов непрерывно изгибаться через пору, так что водная сердцевина выстлана как вставленными пептидами, так и группами липидных головок.

(С) Канал ковра: пептиды разрушают мембрану, ориентируясь параллельно поверхности липидного бислоя и образуя обширный слой или ковер.

Чистый эффект от А до С заключается в том, что некоторые мономеры будут перемещены в цитоплазму и могут отделяться от мембраны и связываться с клеточными полианионами, такими как ДНК и РНК, ингибировать ферментативную активность, такую как синтез белка или сворачивание белка с помощью шаперона. Модифицировано по Бродгену и др.

Среди гистатинов гистатин 5 обладает самой сильной антимикробной активностью, и большая часть исследований посвящена этому пептиду. Он обладает мощной противогрибковой активностью в отношении патогенов Candida albicans, Cryptococcus neoformans и Aspergillus fumigatus. Подобно кателицидинам, гистатин 5 ингибирует лейкотоксическую активность Actinobacillus actinomycetemcomitans и ингибирует ферменты хозяина и бактерий, участвующих в заболеваниях пародонта.

Интересные идеи о важности AP были продемонстрированы несколькими подходами. С одной стороны, истощение АД было связано с несколькими патологическими расстройствами. Например, пациенты со специфическим синдромом гранулярной недостаточности испытывают недостаток α-дефензинов и страдают от тяжелых и частых инфекций. Дефицит пептида кателицидина LL-37 и пептидов нейтрофильных клеток (HNP1-3) у людей, известных как Morbus Kostmann, приводит к тому, что пациенты страдают от частых бактериальных инфекций полости рта и тяжелых заболеваний пародонта. С другой стороны, β-дефензин-1 и СУДОРОГА (связанный с кателином антимикробный пептид; cnlp) истощение гена у нокаутированных мышей приводит к более высокой восприимчивости к инфекциям и неспособности их очистить.

Противовирусная активность: В дополнение к своей антибактериальной активности, АП обладают противовирусной активностью. Α-дефензин HNP-1 ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и вируса гриппа после проникновения вируса в клетки-мишени. Аналогичным образом, HNP-1 может инактивировать вирус папилломы, вирус простого герпеса, цитомегаловирус, вирус везикулярного стоматита и аденовирус.

Другие АП, такие как β- и синтетические θ-дефензины человека (ретроциклин 2) или кателицидины, также блокируют репликацию ВИЧ-1 и инфекции, вызванные вирусом гриппа. Недавняя работа с использованием мышей с дефицитом β-дефензина-1 (BD-1) показала, что BD-1 играет роль в предотвращении репликации вируса в иммунных клетках.

Помимо ингибирования репликации вирусов, дефензины ингибируют проникновение ВИЧ в клетки путем антагонизации вирусных белков, которые сливаются с клетками—мишенями (гликопротеин gp120/gp41-env) или клеточными рецепторами, участвующими в интернализации вируса (рецептор хемокина CXCR4).

В целом, несколько исследований показывают потенциал АП в качестве широкого спектра противовирусных агентов. В отличие от антибактериальной активности, противовирусная активность, по-видимому, зависит от взаимодействия с вирусными белками. Однако лежащие в основе механизмы подавления вируса APS далеки от ясности, и необходимо провести дальнейшие исследования.

Противогрибковая активность: Различные AP проявляют противогрибковую активность. В последние годы число идентифицированных пептидов неуклонно растет. Увеличение числа микозов, развитие устойчивости грибковых патогенов к доступным лекарственным средствам, а также неблагоприятные побочные эффекты этих препаратов привели к активизации усилий по изучению противогрибковой активности APs и выявлению новых кандидатов для терапии.

Механизмы противогрибкового действия АП включают лизис клеток путем связывания и разрушения наружной мембраны, вмешательство в синтез клеточной стенки и индукцию деполимеризации актинового цитоскелета. Предложенные механизмы, по-видимому, аналогичны антибактериальным моделям АП.

Интересно, что в отличие от противовирусных пептидов, где, по-видимому, практически невозможно предсказать противовирусную активность на основе вторичных структур пептида, противогрибковые пептиды, как правило, относительно богаты полярными и нейтральными аминокислотами.

Недавние результаты показали, что образование α–спиральных и/или β-листовых вторичных структур может увеличить амфипатичность APS и позволить им специфически воздействовать на свои мишени в грибковой мембране. Однако точные механизмы до конца не поняты.

Для HNP-1 и-2, а также для NP кроликов (1-3), значительная активность против Candida spp. было показано. Кроме того, гистатины и кателицидины также демонстрируют высокую эффективность против Candida и Cryptococcus spp. На сегодняшний день по меньшей мере 100 различных AP были исследованы на предмет их противогрибковой активности. Таким образом, APS могут представлять собой новое поколение противогрибковых агентов.

Противопаразитарная активность: С идентификацией магайнинов в 1980-х годах исследования показали противопаразитарную активность для этого AP. С тех пор было выявлено много AP с антипаразитарной активностью. В то же время исследования показали эффективность дефензинов и кателицидинов против африканской трипаносомы Trypanosoma brucei, вызывающей сонную болезнь, путем нарушения целостности их клеточных мембран.

Совсем недавно BMAP-18, усеченная форма бычьего миелоидного антимикробного пептида-27 (BMAP-27), продемонстрировала сильное действие против нескольких паразитов, включая трипаносомы и лейшманию spp. При низких концентрациях BMAP-18 нарушает потенциал митохондрий без явного изменения плазматических мембран паразитов, тогда как при более высоких концентрациях индуцируются повреждения мембран у паразитов.

Исследования показали, что несколько АП проявляют противопаразитарные режимы действия, напоминающие их антибактериальные, противовирусные или противогрибковые режимы действия. Например, полученный из кателицидина AP PMAP-23 (свиной миелоидный антимикробный пептид-23) оказывает противоопухолевое и противогрибковое действие, разрушая клеточную мембрану путем образования пор.

Однако исследования взаимосвязи структуры и активности показали, что противопаразитарная активность APS может зависеть от определенных пептидных мотивов. Эти мотивы отличаются от тех, которые необходимы для антибактериальной, вирусной и грибковой активности.

2.2. Иммуномодулирующие и дальнейшие мероприятия

В дополнение к своей роли противомикробных агентов, АП участвуют во многих аспектах иммунитета. В начале 1989 года Террито и др. впервые продемонстрировали, что α-дефензины, полученные из нейтрофильных клеток, являются хемотаксическими по отношению к моноцитам человека. За прошедшие годы было обнаружено множество дополнительных функций APs.

В настоящее время выдвигается гипотеза о том, что иммуномодуляция является основной задачей АП. Тот факт, что минимально необходимые бактерицидные концентрации редко обнаруживались in vivo, подтверждает эту гипотезу. Однако некоторые исследования показали локальные высокие концентрации AP в очагах инфекции и воспаления, которые были достаточны для прямого уничтожения.

Кроме того, высокие внутриклеточные концентрации АП в фагоцитах, таких как нейтрофильные гранулоциты, явно способствуют прямому уничтожению проглоченных микробов. Кроме того, несколько исследований показали чувствительность антимикробной активности к концентрациям катионов, сывороточным и анионным макромолекулам, в то время как иммуномодулирующая активность, по-видимому, менее чувствительна.

Влияние этих функций на врожденный иммунитет может представлять собой новую адъювантную терапию в дополнение к прямой противомикробной активности. В этом контексте APs может повысить эффективность существующих антибиотиков in vivo, вероятно, за счет облегчения доступа антибиотиков в бактериальную клетку, что приводит к синергическому эффекту.

Кроме того, APS могут действовать как адъюванты, стимулирующие врожденный иммунитет с помощью трех основных механизмов: усиление набора иммунных клеток в воспаленный участок, стимулирование активации этих клеток и поляризация их для достижения желаемого ответа (Т-хелперные клетки). В целом это приводит к повышению врожденного, а также адаптивного иммунитета в ответ на инфекции. На рисунке 2 показано краткое описание индукции и потенциальной биологической роли AP.

АП в первую очередь являются хемотаксическими для иммунных и неиммунных клеток. Дефензины, включая α-дефензины (например, HNP1-3) и β-дефензины (β-дефензин человека 3 и 4; HBD3 и 4), рекрутируют фагоциты, нейтрофильные гранулоциты и моноциты в очаг воспаления [81]. Кроме того, HBD1 и HBD3 являются хемотаксическими для незрелых дендритных клеток (IDC) и Т-клеток памяти, тогда как α-дефензины человека избирательно индуцируют миграцию нативных CD4+, CD45+ и CD8+ клеток человека.

Человеческий кателицидин LL-37 является хемотаксическим для моноцитов, Т-клеток и нейтрофилов, но не для дендритных клеток. Интересно, что набор зависит от рецептора, связанного с G-белком (GPCR), формилового пептидного рецептора, подобного 1 (FPRL1; [82]). LL-37 подавляет апоптоз нейтрофилов через этот рецептор.

Что касается дефензинов, HBD2 рекрутирует Т-клетки памяти и IDC через GPCR CC-хемокиновый рецептор 6. В дополнение к хемотаксической активности, дефензины индуцируют активацию тучных клеток, включая дегрануляцию, повышенную выработку простагландина D2 и внутриклеточную мобилизацию Ca2+.

Помимо прямого хемотаксического эффекта, было показано, что как дефензины, так и кателицидины действуют косвенно, индуцируя хемокины, такие как лиганд 2 хемокина (мотив C-C) (CCL2), также известный как хемотаксический белок моноцитов-1 (MCP-1), воспалительный белок макрофагов-3α (MIP-3α; CCL20) и индуцируемый интерфероном-γ белок-10 (IP-10; CXCL10) в эпидермальных кератиноцитах человека.

Кроме того, недавние исследования LL-37 показали интересную двойную роль в связывании ДНК (и РНК) для влияния на воспалительную реакцию. С одной стороны, LL-37 способен связывать собственную ДНК и РНК, которые активируют плазмацитоидные дендритные клетки (PDCS) при псориазе кожного заболевания.

С другой стороны, было показано, что LL-37 взаимодействует и нейтрализует цитозольную ДНК, связанную с псориазом, в кератиноцитах и блокирует активацию воспаления AIM2 (белок, индуцируемый ДНК-сенсором, индуцируемый интерфероном, отсутствующий в меланоме 2).

Рисунок 2. Индукция, примеры локализации и потенциальные биологические роли антимикробных пептидов (APS).

APS также модифицируют экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов для модуляции иммунного ответа. Они влияют на баланс между индукцией воспаления и в то же время защищают организм от пагубных последствий чрезмерной воспалительной реакции. Например, LL-37 индуцирует мощные провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкин-1β (IL-1β) в иммунных и неиммунных клетках, а также противовоспалительные цитокины, такие как IL-10, в глиальных клетках головного мозга или макрофагах.

Кроме того, LL-37 подавляет провоспалительную реакцию, включая как внеклеточную нейтрализацию липополисахарида компонента бактериальной клеточной стенки (ЛПС), так и ингибирование индуцированного ЛПС клеточного ответа, такого как TNF-α, оксид азота и простагландин Е2 [92,93].

Сами цитокины способны увеличивать или уменьшать экспрессию AP. В то время как TNF-α, IL-1β и IL-6 приводят к увеличению экспрессии кателицидина и дефензина, IL-10 подавляет продукцию AP.

Влияние продукции цитокинов, привлечение дендритных клеток и моноцитов к месту повреждения, усиление фагоцитоза и созревание дендритных клеток опосредуются APS для модуляции адаптивных иммунных функций.

Все эти эффекты усиливают поглощение, обработку и презентацию антигенов и стимулируют клональную экспансию Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Предыдущие исследования показали, что совместное введение α-(HNP-1-3) и β-дефензинов (BD-1 и 2 человека) усиливает ответ на овальбумин-специфический иммуноглобулин G (IgG) у мышей.

Наряду с повышенным созреванием iDC, APs индуцируют более эффективную презентацию антигена и последующую активацию Т-клеток. В то же время Мадер и соавт. продемонстрировали, что LL-37 индуцирует апоптоз в цитотоксических и регуляторных Т-клетка.

Интересно, что мыши с дефицитом СУДОРОГ были более восприимчивы к патогенной кожной инфекции. Кроме того, LL-37, HBD-2 и 3 высоко экспрессируются в эпидермальных кератиноцитах в ответ на повреждение или инфекции кожи. Поэтому было высказано предположение, что АФС играют важную роль в поддержании кожного барьера и, возможно, участвуют в его восстановлении.

Гипотеза подтверждается несколькими результатами: Лечение HBD-3 индуцировало реэпителизацию ран на модели свиньи. Было показано, что факторы роста, такие как инсулиноподобный фактор роста I и трансформирующий фактор роста-α, индуцируют экспрессию LL-37 или HBD-3.

Впоследствии индуцированные APS активируют эпителиальные клетки и фибробласты с образованием грануляционной ткани и действуют хемотатически на макрофаги и другие иммунные клетки. В то же время APS увеличивают факторы роста и экспрессию цитокинов в клетках кожного барьера, которые индуцируют и контролируют заживление ран.

Кроме того, Кочулла и др. обнаружили, что LL-37 опосредует ангиогенез и васкулогенез. HBD-3 также участвует в ремоделировании тканей за счет увеличения экспрессии белка матриксных металлопротеаз. В целом, APs, по-видимому, являются многообещающими кандидатами для новых терапевтических подходов к заживлению ран.

Интересно, что нам удалось показать, что экспрессия СУДОРОГ в глиальных клетках крыс индуцируется различными нейротрофическими факторами, например нейротрофическим фактором роста (NGF). Стимуляция СУДОРОГ также приводит к увеличению NGF и других нейротрофических факторов.

Мы предполагаем, что СУДОРОГА участвует в защите мозга и способствует выживанию нейронов после бактериальной инфекции мозга. Кроме того, недавние исследования показывают противоопухолевую активность APs. Например, было показано, что буфорин IIb, 21-аминокислотный AP, полученный из гистона H2A, индуцирует митохондриально-зависимый апоптоз опухолевых клеточных линий и подавляет рост опухолей, имплантированных мышам.

3. Практическое применение

В связи с растущим развитием устойчивости к классическим антибиотикам, а также из-за их противомикробной и другой полезной активности, APS и их производные очень интересны для практического применения.

Около 1000 природных AP могут служить для будущего развития. Однако в настоящее время только несколько АП одобрены для клинического применения. Интересно, что полимиксин В, циклический катионный липопептид из Bacillus polymyxa, был обнаружен в 1947 году. С 1960-х годов полимиксины используются для местного применения.

Другими одобренными препаратами являются линейный полипептид грамицидин, полученный из Bacillus brevis, в виде комбинированного продукта и даптомицин, циклический анионный липопептид. Даптомицин активен только против грамположительных бактерий (инфекции кожи и мягких тканей) и в настоящее время является наиболее бактерицидным препаратом на рынке, используемым в качестве резервного антибиотика против условно-патогенных микроорганизмов (таких как метициллинрезистентный золотистый стафилококк, MRSA).

Низин, полученный из Lactococcus lactis, использовался в качестве пищевого консерванта. Кроме того, следует отметить, что полусинтетические циклические липопептиды (микафунгин, анидулафунгин) являются очень эффективными, клинически одобренными противогрибковыми APS. Синтетический полипептид энфувиртид (фузеон) от Hoffmann-La Roche ингибирует слияние ВИЧ-1 с клетками-хозяевами.

Многочисленные побочные эффекты, высокие затраты и отсутствие ясности в отношении развития резистентности привели к противоречивому обсуждению применений.

Хороший обзор текущей ситуации с клиническими испытаниями, включающими APs, приведен в обзоре Yeung et al. Конечно, в центре внимания находятся две основные функции — противомикробная и иммуномодулирующая активность. Существует вероятность того, что АФС могут назначаться при острых инфекциях, но также и в профилактических целях.

Однако три кандидата, присутствующие на III фазе клинических испытаний, омиганан, пексиганан (от лягушачьего магайнина) и исеганан, не смогли получить одобрение нового лекарственного средства (NDA) из-за нерешенных проблем с дизайном клинических испытаний, конечными точками и неспособностью продемонстрировать преимущество перед существующими терапевтическими средствами.

Еще одно применение в клинических испытаниях — лечение акне. Угревые поражения, вызванные угрями Propionibacterium, связаны с воспалением средней и тяжелой степени; лечение, включающее как противомикробные, так и противовоспалительные средства, принесло бы значительную пользу.

Это может быть улучшено с помощью пептида, полученного из индолицидина, под названием MBI-594AN от Migenix. Этот пептид не только обладает антимикробным действием против P.acnes, но также подавляет высвобождение цитокинов, стимулированных P.acnes. Еще один кандидат от Migenix MX-226 (омиганан), синтетический катионный пептид защиты хозяина, полученный из индолицидина, следует использовать для предотвращения инфекций катетеров, а также является местным антисептиком при ожоговых ранах.

Системные приложения уже рассматривались ранее. На сегодняшний день экономическая эффективность, плохая фармакокинетика (из-за чувствительности АП к протеазам) и неизвестная токсичность ограничивают применение для местного применения. В последнее время произошли некоторые изменения в усилиях по решению этих проблем.

Например, восприимчивость APS к деградации протеазы может быть устранена с помощью различных стратегий, включая препараты в виде пролекарств, пептидомиметики, эквивалентные APS, и использование D- или ненатуральных аминокислот.

Компания Polymedix (США) разработала новую серию полимерных, олигомерных и низкомолекулярных имитаторов APS (серия PMX). В частности, соединение свинца PMX-30063 в настоящее время находится в стадии доклинической разработки для системных инфекций широкого спектра действия.

В литературе существует много новых подходов к APS, которые демонстрируют хорошую доклиническую антимикробную активность. Например, производное NZ2114 из дефензиноподобного аплектазина (выделенного из сапрофитного гриба Pseudoplectania nigrella) демонстрирует высокую эффективность in vivo против MRSA при экспериментальном эндокардите или пневмококке Streptococcus pneumoniae при менингите или пневмонии.

Помимо активности широкого спектра против бактерий, сравнимой с активностью антибиотиков, APS также проявляют противовирусную и/или противогрибковую активность. Например, в случаях заражения вирусами или паразитами, которые могут скрываться в клетках-хозяевах, было показано, что пептиды дермасептина, которые в настоящее время используются в раневых и кожных мазях, действуют на эритроциты человека, инфицированные малярийным паразитом Plasmodium falciparum.

Ряд ацильных модификаций был получен с использованием N-концевых пептидных фрагментов производных дермасептина, линейных катионных пептидов, выделенных из кожи амфибий. Эти липопептиды проявляют быструю бактерицидную активность в отношении биопленок патогенных микроорганизмов полости рта, таких как Streptococcus mutans и Actinomyces viscosus.

Пластилины, как представители суперсемейства дермасептинов, являются повреждающими мембраны пептидами. Человеческий пептид hLF1-11, полученный из лактоферрина, в настоящее время находится в фазе I/II и предназначен для лечения грибковых инфекций. Пептид также демонстрирует высокую эффективность в отношении MRSA.

Кроме того, APS имеют множество мишеней внутри клетки, включая разрушение мембранного барьера и ингибирование внутриклеточных мишеней. По-видимому, множественные мишени снижают риск устойчивости микробов к APS. Хотя устойчивость была продемонстрирована in vitro, она, по-видимому, развивается медленнее, чем устойчивость к антибиотикам. Тем не менее, патогенные микроорганизмы разрабатывают несколько механизмов для защиты от вредных воздействий APS.

Бактериальные сенсорные системы хорошо сохраняются среди патогенов и могут представлять собой привлекательные мишени для разработки новых противомикробных препаратов. Существует вероятность того, что комбинированное введение различных АФС повысит эффективность как с точки зрения комбинированных механизмов действия, так и предотвращения развития резистентности.

Как упоминалось выше, в нескольких исследованиях сообщалось о синергических эффектах между APS и обычными антибиотиками за счет мембранолитического действия или облегчения доступа к внутриклеточным мишеням через мембранопроницаемую активность AP.

Последние разработки показали, что биоактивные покрытия имплантатов с APs защищают от колонизации патогенами и инфекции после операции.

Например, Пфефер и др. сообщили об эффективности титановых поверхностей, покрытых рекомбинированным HBD-2, в отношении антибактериальной активности и предположили, что это может быть перспективным инструментом для лечения инфекций, связанных с хирургией протезирования имплантатов.

Наши собственные исследования показывают многообещающие результаты с покрытием HBD-2 из проволоки Киршнера (рис. 3). Другим применением, в котором была продемонстрирована эффективность, является использование окклюзионной шелковой мембраны, загруженной колистином (торговое название полимиксина Е) для лечения инфицированных ран. Кроме того, покрытие АП используются для предотвращения образования биопленки на имплантатах.

Существует несколько исследований in vitro с использованием дефензинов или гистатина в качестве противомикробных пленок. Многослойные пленки, функционализированные введением дефензинов, подавляют рост инфекционных патогенов. Поэтому полипептидные многослойные тонкие пленки, содержащие APS, считаются перспективными для защиты имплантатов, катетеров, игл, хирургических инструментов, трубок и многих других видов материалов от размножения микроорганизмов.

Еще одним подходом является покрытие контактных линз меламином AP, что привело к предотвращению роста бактерий на контактных линзах и, следовательно, к снижению частоты и тяжести побочных реакций, вызванных грамположительными и отрицательными бактериями во время ношения линз.

Иммуномодулирующая активность APs предполагает дальнейшее потенциальное применение. Это включает в себя применение для заживления ран, в качестве адъювантов вакцин, для борьбы с эндотоксемией и в качестве противоопухолевых препаратов. Важным преимуществом APS является синергическое действие различных пептидов.

При использовании нескольких AP антимикробная активность может быть усилена или дополнена другими функциями, такими как иммуномодулирующая активность или антиэндотоксиновые (LPS) соединения. Опебакан, производное человеческого бактерицидного/повышающего проницаемость белка, в настоящее время находящегося в фазе I/II, убивает бактерии и нейтрализует действие ЛПС.

Помимо противогрибковой активности, hLF1-11 индуцирует дифференцировку моноцитов в сторону макрофагов с улучшенным распознаванием и очисткой от патогенов. Кроме того, рационально разработанный декапептид D-аминокислоты RDP58 был доказан безопасным в клинических испытаниях. Пептид уменьшает провоспалительный цитокиновый ответ, ингибируя внутриклеточные пути воспаления. Применение в качестве регулятора врожденной защиты планируется при различных воспалительных заболеваниях, таких как воспалительные заболевания кишечника, артрит, астма или цистит кишечника.

Было высказано предположение, что дефензины являются антиангиогенными. Такая деятельность может дать новые идеи для разработки нового класса антиангиогенетических препаратов для борьбы с ростом опухолей и раком.

Производное от AP cecropin B, небольшого антибактериального пептида из гигантского шелкопряда Hyalophora cecropia, HB-107, разработанного компанией Helix Biomedix, Inc., улучшает заживление ран по сравнению со скремблированным пептидом и контролем за транспортными средствами, эффект, сравнимый с лечением рекомбинантным человеческим тромбоцитарным фактором роста-β.

Раны, обработанные HB-107, демонстрируют гиперплазию кератиноцитов и повышенную лейкоцитарную инфильтрацию. В целом, в ближайшие годы, безусловно, появятся более интересные и многообещающие детали в этой области.

Рисунок 3. Проволока Киршнера с покрытием HBD-2, используемая для фиксации переломов, проявляет антимикробную активность в отношении грамотрицательных бактерий.

Проволоку покрывали поли-DL-лактидом (PDLLA) (А) или PDLLA и HBD-2 (3 мкг) (Б), и антибактериальную активность в отношении грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa проверяли с помощью теста диффузии агара.

Вкратце, бактериальную суспензию смешивали с подстилающим агаром, разливали в чашки Петри и вставляли проволоку Киршнера. После ночной инкубации при 37 °C верхний агар выливали на нижний агар. Агаровые пластины инкубировали при 37 °C в течение 4 ч и исследовали зоны ингибирования роста.

4. Выводы и перспективы на будущее

В последние десятилетия понимание биологической важности APs значительно возросло. С одной стороны, была предпринята попытка усилить и улучшить противомикробную активность. С другой стороны, их разнообразная иммуномодулирующая активность увеличивает потенциал для дальнейшего применения APS в таких областях, как заживление ран, анти-LPS, в качестве врожденных регуляторов защиты и в качестве противоопухолевых препаратов.

Однако для более широкого применения необходимо решить существующие проблемы, такие как стоимость, устойчивость к протеолитической деградации, восприимчивость к соли, рН и сыворотке, неясная цитотоксичность по отношению к эукариотам и эффективность стандартных антибиотиков.

Недавние открытия и разработки даже показали некоторые возможные решения. С этой точки зрения точки доступа, безусловно, не являются панацеей, но они предлагают интересные возможности для применения с новыми целями. Например, новые инновационные подходы могут быть представлены пониманием развития резистентности микробов к APS наряду с регуляцией врожденного иммунитета, включающей хемотаксис или модуляцию воспалительных путей APS.

Кроме того, APS также может помочь нам понять сложные взаимоотношения и взаимодействие между организмами в форме иммунной системы и патогенов. APS определенно способствуют поддержанию баланса между воспалением и гомеостазом. Это означает, что они являются незаменимым компонентом врожденной иммунной системы. Это делает их привлекательными в качестве потенциальных датчиков и биомаркеров для раннего выявления и профилактики таких заболеваний, как сепсис.

В заключение хотим сказать, что, хотя в настоящее время в клинической практике используется мало АП, но не исключено, что использование АП в качестве терапевтических средств резко возрастет в ближайшие годы. Это включает их использование в качестве противомикробных препаратов, а также адъювантное применение для поддержки других методов лечения.

Ссылка на оригинал статьи (англ. язык)

Antimicrobial Peptides: Multifunctional Drugs for Different Applications [В Интернете] / авт. Lars-Ove Brandenburg, Julika Merres, Lea-Jessica Albrecht, Deike Varoga, Thomas Pufe // Open Access Journals. — https://www.mdpi.com/2073-4360/4/1/539/htm#